Sviluppo di un approccio all'idrolisi proteica per aumentare i benefici nutrizionali di carne e pesce preparati al momento.
Un documento di supporto scientifico del dottor Adrian Hewson-Hughes | Consulente per la nutrizione, la sicurezza alimentare e l'innovazione, GA Pet Food Partners.
Introduzione.
Il contenuto di proteine animali è ben noto come l'essenza degli alimenti di alta qualità per cani e gatti e molti proprietari di animali domestici riconoscono che qui si applica l'adagio "qualità rispetto alla quantità". Secondo la società di ricerche di mercato Mintel, il 59% dei proprietari di gatti e il 57% dei proprietari di cani affermano che la qualità della carne è più importante del contenuto complessivo di carne negli alimenti per animali domestici (MINTEL, 2017).
GA Pet Food Partners lo ha riconosciuto da tempo. Dall'introduzione del Freshtrusion®, GA ha aperto la strada allo sviluppo e alla produzione di diete contenenti quantità crescenti di fonti proteiche di carne e pesce preparate al momento. I vantaggi dell'utilizzo di fonti di carne e pesce fresche rispetto a pasti a base di carne e pesce essiccati e cotti, inclusi un gusto migliore e una maggiore digeribilità, sono molto apprezzati sia dagli animali domestici che dai loro proprietari.
Impegnarsi per offrire ai nostri Partner prodotti ancora migliori.
Il mercato degli alimenti per animali domestici è molto dinamico e, sebbene evidenziare l'esatta proporzione elevata di carne/pesce/pollame nei prodotti sia una mossa saggia, questa sta diventando un'aspettativa di base piuttosto che la qualità desiderata per questi prodotti dai proprietari di animali domestici. In GA, siamo costantemente alla ricerca di modi per offrire ai Partner prodotti ancora migliori, ed è per questo che abbiamo deciso di fare l'apparentemente impossibile: trovare un modo per cucinare i nostri ingredienti freschi di carne e pesce per renderli ancora migliori per gli animali domestici .
L'idea è di aumentare il valore nutritivo delle proteine contenute nei nostri ingredienti freschi di carne e pesce convertendo le proteine in piccoli peptidi, che vengono assorbiti più facilmente dagli animali domestici che li mangiano (lo chiamiamo 'HDP' – Proteina Altamente Digeribile). Per aiutarci in questa ricerca, abbiamo identificato esperti presso Nofima, un istituto di ricerca leader per la ricerca alimentare applicata con sede in Norvegia, per ottimizzare le condizioni per la digestione enzimatica di materie prime selezionate di carne e pesce e analizzarle per dimostrare che potremmo ottenere ciò che volevamo .
Digestione delle proteine – alias proteolisi o idrolisi
Le proteine sono grandi molecole costituite da singoli "mattoni" chiamati amminoacidi. Dopo aver mangiato cibo contenente proteine, inizia il processo di proteolisi quando gli enzimi rilasciati in diverse parti del tratto gastrointestinale lo scompongono in amminoacidi e piccoli peptidi. Ciò consente a questi elementi costitutivi di essere assorbiti nel corpo, dove possono essere ricombinati per costruire nuove proteine (come muscoli, pelle, capelli, anticorpi, enzimi, ormoni, ecc.).
È anche possibile che le fonti proteiche subiscano un processo di proteolisi enzimatica controllata come parte della loro preparazione per l'inclusione negli alimenti trasformati e nei prodotti nutrizionali. Ad esempio, gli idrolizzati proteici sono stati utilizzati per decenni nell'alimentazione umana, in particolare nella produzione di latte artificiale ipoallergenico per neonati/bambini allergici alle proteine del latte vaccino.
Idrolisi enzimatica o chimica
L'idrolisi proteica - la rottura dei legami peptidici che uniscono gli amminoacidi attraverso l'aggiunta di acqua - può essere ottenuta con diversi metodi: chimicamente utilizzando acidi o basi (alcaline) o enzimaticamente (l'approccio su cui ci stiamo concentrando). Mentre i metodi di idrolisi acida e alcalina delle proteine offrono il vantaggio del basso costo, ci sono conseguenze negative in termini di qualità nutrizionale degli idrolizzati prodotti. L'idrolisi acida provoca la completa distruzione dell'aminoacido essenziale triptofano, nonché la parziale perdita di metionina, cistina e cisteina (Pasupuleki e Braun, 2010). Allo stesso modo, l'idrolisi alcalina provoca la completa distruzione della maggior parte degli amminoacidi, sebbene il triptofano possa sopravvivere intatto (Dai, et al.2014), (Ho, et al., 2017).
Rispetto all'idrolisi acida e alcalina, i principali vantaggi dell'idrolisi enzimatica delle proteine sono:
- Le condizioni di idrolisi come temperatura e pH sono lievi e non determinano alcuna perdita nota di aminoacidi.
- L'uso dell'enzima(i) della proteasi è più specifico e preciso nel controllare l'entità dell'idrolisi e la dimensione dei peptidi.
- Le piccole quantità di enzima utilizzate possono essere facilmente disattivate (ad es. riscaldando a 80 – 85ºC per almeno 3 minuti) per arrestare la reazione di idrolisi. (Ho, et al., 2017).
Benefici nutrizionali delle proteine idrolizzate enzimaticamente: digeribilità e assorbimento delle proteine.
Oltre al metodo di idrolisi proteica utilizzato, come evidenziato in precedenza, il valore nutritivo degli idrolizzati proteici dipende dalla composizione di aminoacidi liberi, piccoli peptidi (tipicamente di- e tri-peptidi) e grandi peptidi presenti. Storicamente si credeva che solo gli amminoacidi liberi fossero assorbiti dal tratto gastrointestinale da specifici trasportatori di amminoacidi. Ciò si verifica, ma ora è riconosciuto che la maggior parte degli amminoacidi viene assorbita come di- e tri-peptidi dal trasportatore peptidico ad ampia specificità PepT1 (Fei, et al., 1994). PepT1 può potenzialmente trasportare tutti i 400 di-peptidi e 8,000 tripeptidi che risultano dalla combinazione dei 20 diversi aminoacidi alimentari (Daniele, 2004). Pertanto ci si aspetterebbe che l'ingestione di un idrolizzato proteico contenente elevate proporzioni di di- e tripeptidi faciliti la digestione e l'assorbimento delle proteine, con conseguente aumento della digeribilità e della biodisponibilità degli aminoacidi.
Chiaramente, stabilire le migliori condizioni enzimatiche e di idrolisi è fondamentale per poter creare idrolizzati proteici con i profili di dimensione del peptide finale desiderati. La distribuzione dimensionale dei peptidi può essere determinata utilizzando una tecnica chiamata cromatografia ad esclusione dimensionale. La cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC) è una tecnica di chimica analitica in cui miscele di molecole (come proteine o peptidi) disciolte in una soluzione sono separate dalla loro dimensione (come illustrato nella figura 1).
FIGURA 1. Semplice panoramica della separazione di molecole di diverse dimensioni in una soluzione mediante cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC). La soluzione viene applicata su una colonna impaccata con una resina di perline sferiche porose (sfere grigie). Le molecole grandi (cerchi rossi) non saranno in grado di entrare nei pori (fori) delle perline e quindi passare lungo la colonna in modo relativamente rapido e verranno rilevate per prime. Le molecole più piccole all'interno del campione possono entrare nei pori in varia misura a seconda delle loro dimensioni. Le molecole "di medie dimensioni" (cerchi verdi) potranno entrare in alcune perline ma non in altre e quindi impiegheranno più tempo a passare attraverso la colonna, mentre le molecole più piccole (cerchi blu) potranno entrare in tutti i pori e prenderanno il più lungo per passare attraverso la colonna.
Metodi
Materie Prime – Campioni freschi di carcasse di pollo, carcasse di anatra e carcasse di salmone sono stati ridotti di dimensioni, omogeneizzati in una pasta densa e congelati. Il fegato di agnello fresco era congelato intero. I materiali sono stati inviati a Nofima, Ås, Norvegia, per proteolisi e analisi.
proteolisi – Per ciascuna materia prima (pollo, anatra, salmone e agnello), un campione da 500 g è stato mescolato con 990 ml di acqua distillata in un recipiente di reazione di vetro e agitato a 300 giri/min. Per ciascuna materia prima, sono stati testati tre diversi enzimi proteasi a due diverse concentrazioni e due punti temporali risultanti in 48 campioni di idrolizzato per l'analisi.
Cromatografia ad esclusione STERICA – La distribuzione del peso molecolare della frazione proteica idrosolubile degli idrolizzati è stata determinata mediante cromatografia ad esclusione dimensionale utilizzando un sistema di cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) Shimadzu LC-20AT con un rivelatore a matrice di fotodiodi (SPD M20A) impostato a 214 nm.
Contenuto di peptidi di collagene – L'idrossiprolina è un aminoacido modificato, la cui presenza è principalmente confinata al collagene. Il contenuto di idrossiprolina negli idrolizzati proteici può essere utilizzato come misura indiretta della quantità di collagene/peptidi di collagene presenti. Un'analisi completa degli aminoacidi (compresa l'idrossiprolina) di ciascuna materia prima è stata effettuata da Nofima Biolab; inoltre, il contenuto di idrossiprolina è stato determinato presso un laboratorio accreditato (ALS, Norvegia) nella frazione idrosolubile degli idrolizzati.
Risultati
Distribuzione delle dimensioni dei peptidi degli idrolizzati – In generale, per ogni enzima testato, l'incubazione di ciascuna materia prima con la concentrazione di enzima più alta e per una durata maggiore ha comportato uno spostamento "benefico" nel profilo dimensionale dei peptidi degli idrolizzati (cioè un aumento della proporzione di peptidi più piccoli ). Ciò è evidenziato nella Figura 2, che mostra i risultati per ciascuna materia prima utilizzando l'enzima "migliore" a concentrazione e durata "non ottimali" rispetto a concentrazione e durata "ottimali". Con condizioni ottimizzate, abbiamo scoperto che il 100% dei peptidi era ≤3 kDa e oltre il 75% era < 0.5 kDa (Figura 2).
Sulla base dell'evidenza collettiva di numerosi studi su un certo numero di specie (ad es. ratto, maiale, cane, uomo; cfr (Zhangi & Matthews, 2010) per una panoramica, è generalmente ben accettato che:
- L'assorbimento dei peptidi è migliore rispetto alle proteine intatte.
- L'assorbimento dei peptidi è migliore degli aminoacidi liberi.
- L'assorbimento di piccoli peptidi è migliore di quello di grandi peptidi.
Fisiologicamente, la maggior parte degli amminoacidi viene assorbita come piccoli peptidi costituiti da 2 o 3 amminoacidi uniti tra loro (rispettivamente di- e tri-peptidi). Pertanto ci si aspetterebbe che l'ingestione di un idrolizzato proteico contenente elevate proporzioni di di- e tripeptidi faciliti la digestione e l'assorbimento delle proteine, con conseguente aumento della digeribilità e della biodisponibilità degli aminoacidi. Il peso molecolare medio di un amminoacido è 110 Dalton (Da), quindi di- e tri-peptidi avrebbero un peso molecolare di circa 220-330 Da (0.2-0.3 kDa). I nostri risultati nel raggiungimento di idrolizzati proteici con oltre il 75% di peptidi inferiori a 0.5 kDa (cioè fino a ~ 5 aminoacidi) significano che le proteine nelle nostre crocchette sarebbero altamente digeribili e facilmente assorbite dagli animali domestici che le mangiano. Si prevede di dimostrarlo attraverso uno studio sull'alimentazione in collaborazione con la Facoltà di Medicina Veterinaria dell'Università di Gand.
Inoltre, il raggiungimento del 100% di peptidi di 3 kDa o inferiori diminuisce il rischio di scatenare una reazione allergica alle fonti proteiche e può quindi essere considerato ipoallergenico.
Immagine 2.
Distribuzione dimensionale (kDa) dei peptidi nella fase acquosa degli idrolizzati di ciascuna materia prima incubata con lo stesso enzima in condizioni "non ottimizzate" e "ottimizzate" in termini di concentrazione enzimatica e durata dell'idrolisi. Si noti in particolare come la percentuale di peptidi compresa tra 1.0-3.0 kDa diminuisce e i peptidi <0.5 kDa aumentano, passando da condizioni "non ottimizzate" a condizioni "ottimizzate".
Contenuto di peptidi di collagene
Per ciascuna materia prima testata, gli enzimi A e C si sono comportati 'meglio' in generale (in termini di recupero di una percentuale maggiore di idrossiprolina nella fase acquosa degli idrolizzati) rispetto all'enzima B quando si confrontano una data durata dell'idrolisi e concentrazione dell'enzima (es. risultati per il salmone nella figura 3).
Poiché la proteina di collagene "intatta" non è solubile in acqua, la presenza di idrossiprolina (il nostro marker di "collagene") nella fase acquosa indica che la proteina di collagene è stata digerita in peptidi di collagene (che sono solubili in acqua). I nostri risultati illustrano che siamo in grado di utilizzare la proteolisi enzimatica per creare materie prime in grado di apportare potenziali benefici funzionali come sostenere la salute delle articolazioni, la salute della pelle e la salute dell'intestino attraverso i peptidi di collagene presenti al loro interno.
FIGURA 3. Percentuale di idrossiprolina (un aminoacido presente quasi esclusivamente nel collagene) recuperata nella fase acquosa del salmone idrolizzato con tre diversi enzimi (A, B o C) incubato con la materia prima (salmone) a due diverse concentrazioni (C1 o C2) per due diversi periodi di tempo (T1 o T2).
Conclusione
Questi risultati positivi presentano opportunità per ottenere un valore aggiunto dalla presenza naturale di collagene all'interno di determinate materie prime creando peptidi di collagene con il potenziale di fornire benefici funzionali come il mantenimento delle articolazioni sane negli animali domestici attivi e il miglioramento della mobilità e flessibilità delle articolazioni negli animali domestici più anziani, per esempio.
Con l'elevata percentuale (>75%) di piccoli peptidi (<0.5kDa) prodotti in condizioni "ottimizzate" sulla base di questa ricerca, la prima parte del nostro HDP obiettivo è raggiunto. Il prossimo passo importante è dimostrare che le crocchette prodotte con questo HDP sono effettivamente più digeribili e biodisponibili rispetto ai nostri prodotti appena preparati esistenti: siamo impegnati a eseguire questo in uno studio sull'alimentazione con il Università di Gand Scuola di veterinaria. Guarda questo spazio!
Riferimenti
- Cave, N., 2006. Diete proteiche idrolizzate per cani e gatti. Cliniche veterinarie Pratica per piccoli animali, volume 36, pp. 1251-1268.
- Dai, Z., Wu, Z., Jia, S. & Wu, G., 2014. Analisi della composizione degli amminoacidi nelle proteine dei tessuti animali e degli alimenti come derivati dell'o-ftaldialdeide precolonna mediante HPLC con rilevamento della fluorescenza. J Cromatografia B, Volume 964, pp. 116-127.
- Daniel, H., 2004. Fisiologia molecolare e integrativa del trasporto dei peptidi intestinali. Rassegna annuale di fisiologia, volume 66, pp. 361-384.
- Fei, Y. et al., 1994. Clonazione dell'espressione di un trasportatore oligopeptidico accoppiato a protoni di mammifero. Nature, Volume 7, pp. 563-566.
- Hanaoka, K. et al., 2019. Caratterizzazione del peso molecolare di proteine e peptidi durante la produzione di palatanti per alimenti per animali domestici. [Online] Disponibile su: https://www.diana-petfood.com/emea-en/publications/
- Hou, Y. et al., 2017. Idrosati proteici nell'alimentazione animale: produzione industriale, peptidi bioattivi e significato funzionale. Journal of Animal Science and Biotechnology, pp. 24-36.
- Knights, R., 1985. Elaborazione e valutazione di idrolizzati proteici. In: Nutrizione per bisogni speciali. New York: Marcel Dekker, pp. 105-115.
- MINTEL, 2017. Maggiore trasparenza in termini di proteine nel pet food, sl: MINTEL REPORTS.
- Pasupuleki, VK, Braun, S, 2010. Produzione all'avanguardia di idrolizzati proteici. In: Idrolizzati proteici in biotecnologia. New York: Springer, pp. 11-32.
- Zhangi, B. & Matthews, J., 2010. Importanza fisiologica e meccanismi di assorbimento dell'idrolizzato proteico. In: Idrolizzati proteici in biotecnologia. New York: Springer, pp. 135-177.